如何在线设计qPCR引物
设计引物原则
（1）引物最好在模板cDNA的保守区内设计；
（2）引物长度一般在15~30碱基之间，过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应；
（3）引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度，一般计算公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值；
（4）引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性；
（5）引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了；
（6）引物扩增长度：一般RT-PCR引物扩增长度在100-200bp,常规PCR扩增长度建议200-500bp。一般PCR产物达到2-3k长度也是可以的，但要考虑到可能引入突变，因此建议使用高保真的聚合酶。
如何利用GraphPad Prism软件分析QPCR数据
第一步：在电脑上安装好GraphPad Prism软件，安装此软件在百度上可以下载，一般下载GraphPad Prism5中文版的。
第
二步：完成第一步后在电脑上打开GraphPad Prism软件，会弹出对话框welcome to GraphPad
Prism，点击左边的Column，选择右边的choose a graph第一排的第四个柱形图。其他部位不需要修改，点击右下角的Create。
第三步：第二步结束后会弹出一个新的对话框，接着你在ABCD等等那一排的下面的空白框里面输入你的实验分组（比如Control，Sample组之类的，以Control组和EAE组为例）。
第四步：第三步结束之后，往实验分组对应的下方添加你的QPCR实验数据。点击Graphs底下的Data-1。会弹出你的实验结果柱状图。
第五步：将X-title删掉，Y-title改成QPCR的Relative Expression，把Data-1改成你设计的引物，比如occludin。
第
六步：结束第五步后开始进行统计学分析。点击左上方Analysis下面的Analyze。会弹出Analyze Data的对话框。将Column
analyses下面改成t test（and nonparametric
tests），点击OK出现新对话框，再点击OK，出现新对话框，上面显示p value
summary为三颗星，即代表该数据具有统计学意义，并且为三颗星。
第七步：返回属性图数据。即点击左边的Graphs下面的Data 1，点击最上面的Draw下面横线，选择横线，点击Write下面的黑体字T，在横线上面标记星号或者ns即可。该例子里的统计学分析为3颗星。完美的QPCR数据分析图就做出来啦。